Explore as Evidências: Visão Geral

O predador oculto nas doenças de retina.

Os estudos de evidências experimentais mostraram que Ang-2 e VEGF atuam juntos para provocar a instabilidade vascular, caracterizada por extravasamento vascular, neovascularização e inflamação.1

Visão geral

Na retina, em condições patológicas, ocorre um switch angiogênico, que desloca o equilíbrio de fatores antiangiogênicos para pró-angiogênicos, incluindo o aumento da atuação de Ang-2.1

Relevância clínica

Os níveis de Ang-2 são elevados nas doenças vasculares da retina e da coroide, enquanto os níveis de ANG-1 permanecem equilibrados.2,3

Ang-1

Níveis de Ang-1 em amostras de vítreo humano

Os níveis de Ang-1 foram semelhantes nas amostras de vítreo de pacientes com doenças vasculares da retina ou da coroide e em amostras de indivíduos sadios, o que sugere expressão estável em condições normais e patológicas.2,3

Valores medianos

Adaptado de: Regula JT et al. EMBO Mol Med. 2019;11:e10666.

Ang-2

Níveis de Ang-2 em amostras de vítreo humano

Os níveis de Ang-2 estão aumentados no vítreo de pacientes com doenças vasculares da retina e da coroide, incluindo DMRI, RD e OVR2,3, o que corrobora o papel da via Ang-2-Tie2 nesses quadros patológicos.

Valores medianos

*p<0,05. ****p<0,0001.
Uma análise não paramétrica de Kruskal-Wallis seguida pelo método de Dunn para comparações múltiplas foi usada para mostrar diferenças significativas entre os grupos e o controle.

Adaptado de: Regula JT et al. EMBO Mol Med. 2016;8(11):1265-88.

Evidências pré-clínicas

Estudos mostraram que a Ang-2 aumenta a inflamação e o extravasamento vascular, facilitando, assim, os efeitos do VEGF3,5. Analise as evidências a seguir:

Extravasamento Vascular e Neovascularização

ENSAIO DE MILES NO MODELO DE PELE DE CAMUNDONGO

Ang-2 pode atuar como facilitador para o extravasamento vascular induzido por VEGF5.

Visualização do
extravasamento vascular

Imagem: ensaio de Miles mostrando o extravasamento vascular em camundongos do tipo selvagem e com deficiência de ANG-2 [Adaptado de: Benest AV et al. PLoS One. 2013;8:e70459]

Quantificação do
extravasamento vascular

**p <0,01. As barras de erro representam a média ± DP.
Adaptado de: Benest AV et al. PLoS One. 2013;8:e70459.

O gráfico quantifica o extravasamento vascular em
camundongos do tipo selvagem e com deficiência de Ang-2.

O extravasamento vascular induzido por VEGF é atenuado em camundongos com deficiência de Ang-2.

Foi demonstrado que a Ang-2 atua como facilitadora da instabilidade vascular induzida por citocinas e também prepara o endotélio para a adesão de leucócitos induzida por TNF-α. Com base nisso, Benest et al. levantaram a hipótese de que a Ang-2 também possa atuar como facilitadora de citocinas indutoras de extravasamento vascular, como VEGF, histamina e bradicinina.

Foi conduzido um ensaio de Miles em camundongos com deficiência de Ang-2 comparados a camundongos do tipo selvagem como controle. O ensaio de Miles avalia a capacidade de uma citocina injetada sob a pele, p. ex. VEGF, induzir extravasamento vascular em comparação a uma substância de controle (solução salina), medindo o extravasamento da vasculatura do contraste azul de Evans, ligado à albumina e injetado por via intravenosa. Esse extravasamento pode ser observado visualmente pela coloração azul da pele e pode ser quantificado por absorbância.

O extravasamento vascular induzido por VEGF foi menor nos camundongos com deficiência de Ang-2 em comparação aos controles do tipo selvagem, e resultados semelhantes foram observados com as citocinas histamina e bradicinina. Esses achados indicam que a Ang-2 atua como um facilitador essencial do extravasamento vascular induzido por essas citocinas.

MODELO DE CAMUNDONGO COM NVC ESPONTÂNEA†

A inibição da Ang-2 promove uma redução sustentada do extravasamento vascular de lesões de neovascularização da coroide (NVC5).

1 semana após a última dose do anticorpo

3 semana após a última dose do anticorpo

5 semana após a última dose do anticorpo

**p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. As barras de erro representam a média ± DP.

†O experimento envolveu camundongos JR5558 com 7 semanas de vida (5-10 camundongos por grupo).

A redução da área de extravasamento da NVC é mais prolongada com inibição da Ang-2 do que com inibição do VEGF.

A neovascularização da coroide (NVC) danifica progressivamente a retina. Assim, tanto o VEGF quanto a Ang-2 parecem desempenhar um papel na neovascularização, na disfunção endotelial e no extravasamento vascular. Esse experimento teve por objetivo elucidar os papéis do VEGF e da Ang-2 na neovascularização patológica e no extravasamento vascular.

Esse experimento foi realizado em um modelo de camundongo com NVC espontânea (JR5558), desenvolvendo espontaneamente lesões neovasculares com extravasamento. Os anticorpos contra VEGF-A e Ang-2 foram administrados por injeção intraperitoneal e foi realizada uma angiografia com fluoresceína (FA) no momento basal e em vários intervalos (1, 3 e 5 semanas após o tratamento). Os tecidos foram coletados e o tamanho da lesão de NVC foi definido com base nas medidas de extravasamento da NVC na FA para determinar os efeitos imediatos e de longo prazo sobre o tamanho, o extravasamento e a atividade da lesão.

Ao comparar a inibição do VEGF com a inibição da Ang-2, resultou-se em um prolongado efeito de redução do extravasamento vascular das lesões de NVC. Os efeitos da inibição da ANG-2 duraram pelo menos 5 semanas após o tratamento, mas a inibição do VEGF perdeu o efeito após 3 semanas. Esses achados sugerem um papel mais preponderante da Ang-2 na mediação do extravasamento vascular sustentado.

ENSAIO TEER* EM CÉLULAS ENDOTELIAIS HUMANAS

Inibição de Ang-2 ou adição de Ang-1 melhora a integridade da barreira de células endoteliais3.

*Técnica quantitativa para medir a integridade da dinâmica das junções estreitas em monocamadas de células endoteliais (e epiteliais).

Adaptado de: Regula JT et al. EMBO Mol Med. 2016;8(11):1265-88.

O VEGF-A reduz a integridade das junções estreitas entre as células endoteliais
A inibição de Ang-2 ou a adição de Ang-1 melhora a integridade da barreira.

A quebra da barreira endotelial e o extravasamento vascular resultante causam edema e perturbam o funcionamento fisiológico da retina. O VEGF-A induz a perda da função da barreira endotelial, mas o papel das angiopoietinas na integridade da barreira endotelial ainda não é claro.

TEER é uma técnica quantitativa para medir a função de barreira em camadas de células endoteliais. Eletrodos são colocados em ambos os lados de uma camada de células em uma membrana semipermeável e, depois, aplica-se um sinal de corrente alternada. As medidas feitas por TEER avaliam a resistência elétrica por meio de uma monocamada de células, indicando a integridade das junções estreitas entre células endoteliais e a permeabilidade da monocamada endotelial. Nesse estudo, células endoteliais humanas dispostas em filtros foram avaliadas quanto à função da barreira endotelial ao longo do tempo após adição de VEGF-A isolado ou combinado com Ang-1, anti-Ang-2 ou ambos, Ang-1 e anti-Ang-2.

Quando as células foram tratadas com VEGF-A, a função da barreira de células endoteliais foi dramaticamente reduzida. A adição de Ang-1 ou anti-Ang-2 com VEGF-A melhorou ligeiramente a integridade da barreira, enquanto a adição de ambos, anti-ANG-2 e ANG-1 com VEGF-A, promoveu um resultado de melhora ainda maior. Esses achados sugerem que tanto VEGF-A quanto Ang-2 provocam o rompimento da barreira endotelial, enquanto Ang-1 promove a integridade da barreira.

Inflamação

Ang-2 promove adesão e transmigração de leucócitos.6,7

Durante a inflamação, citocinas como o TNF-α induzem a expressão de moléculas de adesão na superfície da célula endotelial, mediando a atração e a rolagem de leucócitos. A Ang-2 atua como amplificador, ativando e sensibilizando as células endoteliais às citocinas inflamatórias, regulando a transição da rolagem para a firme adesão dos leucócitos e facilitando a migração dos leucócitos por meio do endotélio vascular para dentro de tecidos como a retina.

Adaptado de: Augustin HG, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10:165-77.

MODELO DA CÂMARA DE PREGA CUTÂNEA DORSAL DO CAMUNDONGO

Adesão dos leucócitos

Tipo selvagem

As barras de erro representam a média ± DP. Reproduzido de Nature Medicine, 12(2), Fiedler U et al. Angiopoietin-2 sensitizes endothelial cells to TNF-alpha and has a crucial role in the induction of inflammation, 235–9, Copyright (2006), com permissão da Springer Nature.

Deficiente em Anh-2

As barras de erro representam a média ± DP. Reproduzido de Nature Medicine, 12(2), Fiedler U et al. Angiopoietin-2 sensitizes endothelial cells to TNF-alpha and has a crucial role in the induction of inflammation, 235–9, Copyright (2006), com permissão da Springer Nature.

Em camundongos com deficiência de Ang-2, a adesão dos leucócitos é defeituosa, o que sugere um importante papel da Ang-2 na resposta inflamatória.

Durante a inflamação, estímulos exógenos como o TNF-α ativam as células endoteliais induzindo a expressão de moléculas de adesão, o que leva à rolagem dos leucócitos seguida de firme adesão, resultando em migração transendotelial dos leucócitos. Esse estudo teve por objetivo entender o papel da Ang-2 na regulação desses processos inflamatórios.

Uma rede de titânio foi implantada na prega cutânea dorsal de camundongos controle do tipo selvagem e deficientes em Ang-2, para formar um sanduíche com uma dupla camada de pele. Uma camada de pele foi removida, sendo deixada uma camada formada por músculo estriado, tecido subcutâneo e epiderme, que foi coberta por uma lamínula de vidro para permitir observações da vasculatura ao microscópio.
Os camundongos controle do tipo selvagem e os deficientes em Ang-2 receberam uma injeção intravenosa de um corante fluorescente que permitiu a visualização dos leucócitos na vasculatura. O TNF-α foi administrado sobre a pele e os mesmos vasos foram observados após 10 minutos, 1 hora e 2 horas. Os leucócitos seriam considerados aderentes se permanecessem estacionários por pelo menos 30 segundos. Os leucócitos em rolagem foram relatados como o percentual das células não aderentes observado em 30 segundos. 

Nos camundongos do tipo selvagem, após estímulo com TNF-α, o número de leucócitos em rolagem aumentou e depois voltou aos níveis basais, e o número de leucócitos aderentes aumentou ao longo do tempo. Nos camundongos deficientes em Ang-2, após estímulo com TNF-α, a rolagem dos leucócitos aumentou ao longo do tempo e foram observadas menos células aderentes em comparação aos camundongos do tipo selvagem. Esses achados sugerem um papel da Ang-2 no controle da transição de rolagem para firme adesão dos leucócitos ou da sensibilidade geral das células endoteliais aos estímulos inflamatórios (como o TNF-α).

Legenda: DMRI: degeneração macular relacionada à idade. ANG: angiopoietina. NVC: neovascularização da coroide. RD: retinopatia diabética. CE: célula endotelial. FA: angiografia com fluoresceína. FFA: angiografia com fluoresceína do fundo de olho. DMRIn: degeneração macular relacionada à idade com neovascularização. OVR: oclusão da veia da retina. TEER: resistência elétrica transendotelial. TIE: tirosina-quinase com domínios semelhantes a imunoglobulinas. TNF-α: fator de necrose tumoral alfa. VEGF, fator de crescimento endotelial vascular.

Referências: 1. Saharinen P et al. Nat Rev Drug Discov. 2017;16:635-61. 2. Regula JT et al. EMBO Mol Med. 2019;11:e10666. 3. Regula JT et al. EMBO Mol Med. 2016;8:1265-88. 4. Benest AV et al. PLoS One. 2013;8:e70459. 5. Chakravarthy U et al. Apresentado no encontro virtual ARVO em maio de 2020. 6. Augustin HG et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10:165-77. 7. Fiedler U et al. Nat Med. 2006;12:235-9.

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